Отрывок из:

АКАДЕМИЯ ВЕТЕРИНАРИИ, ПРОГРАММА ВЕТЕРИНАРНОЙ БЕЗОПАСНОСТИ ПИЩИ, ДЕПАРТАМЕНТ АНАТОМИИ И ФИЗИОЛОГИИ, ДЕПАРТАМЕНТ АНАТОМИИ И ФИЗИОЛОГИИ, RAIMONDA AURYLĖ, Исследование ФЕРМЕНТАЦИИ МОЛОКА РАЗНЫХ ЛАКТОБАЦИЙ, магистерская диссертация, научный руководитель: проф. д-р Вайдас Обераускас

 1.3. Пробиотики

Пробиотики - это живые микроорганизмы, микробные пищевые добавки, оказывающие положительное и естественное влияние на микрофлору желудочно-кишечного тракта (Abe и др.. 1995; Fuller, 1989). 

Термин "пробиотики" был впервые использован в 1965 году Лилли и Стиллвелом для описания эффекта одного микроорганизма, действующего против другого. С тех пор этот термин применяется к добавкам с живыми микроорганизмами, которые улучшают состав микрофлоры желудочно-кишечного тракта (Kačerauskis et al., 2003). Пробиотики буквально означает "для жизни". В настоящее время этот термин относится к живым микроорганизмам или ферментированным с их помощью продуктам, которые приносят пользу организму человека или животного, поддерживая или улучшая баланс микрофлоры кишечника. Большинство экспертов определяют пробиотические бактерии как эубиотики (представители нормальной микрофлоры кишечника и других полостей организма, обычно бифидобактерии и Lactobacillus род молочнокислой микрофлоры), известные как классические пробиотики (Kačerauskis et al., 2003).

Наиболее распространенными штаммами пробиотиков являются: Lactobacillus - Lactobacillus acidophilus, L. casei, L. rhamnosus и Bifidobacterium, Enterococcus, Pediococcus, и Streptococcus штаммы бактерий в родах. Lactobacillusв естественном виде содержатся в молоке, зерновых и других растениях (Quillien, 2001; Michalík и др.., 1999; Fuller, 1989).

Выявлено около 400-500 родов кишечных бактерий. Подавляющее большинство кишечных бактерий полезны. В одном грамме содержимого толстого кишечника обитает 10 - 

1000 миллиардов бактерий. В сложном взаимодействии различных видов каждый тип бактерий играет свою роль, и соотношение бактерий друг с другом влияет на здоровье. В зависимости от того, какие виды преобладают, зависит наше здоровье. В толстом кишечнике преобладают следующие роды: Bacteroides, Bifidobacterium, Eubacterium и Peptostreptococcus. Меньше, но не менее важны Стрептококки, лактобациллы, энтерококки и клостридии племена и Enterobacteriaceae семья. В кишечнике содержатся бактерии, которые в больших количествах становятся вредными, т.е. Veillonellae, Clostridium, Staphylococcus, Proteus и Pseudomonas. Они приводят к образованию конечных продуктов метаболизма, таких как аммоний, сероводород, амины, фенолы, индолы и вторичные желчные кислоты. Эти вещества оказывают неблагоприятное воздействие при всасывании в кровь и непосредственно в слизистую оболочку кишечника. Полезные бактерии гораздо более многочисленны, чем вредные. Баланс микробиоты может быть нарушен в результате применения антибиотиков, изменения пищевых привычек или заболеваний желудочно-кишечного тракта. (www.valio.lt. Accessed 10.12.2012) 

Эти микроорганизмы добавляют в качестве пищевых добавок в йогурты, творог, кефир, а также в виде лиофилизированных порошков (капсул, микрокапсул), таблеток и жидких суспензий (Рейд и др.., 2003). 

1.3.1. Свойства пробиотиков

В человеческом организме живут миллиарды бактерий, которые составляют микробиоту человека. Хорошие бактерии важны для пищеварения и иммунитета. Они также важны для профилактики и лечения различных заболеваний (Isolauri  и др., 2002; Levy, 2000).  

Пробиотики должны обладать следующими свойствами:

• Способны колонизировать определенные полости тела, прикрепляясь к рецепторам на эпителиальных клетках слизистой оболочки кишечника или других полостей;
• Быть непатогенным, генетически стабильным, нетоксичным;
• Вырабатывают противомикробные вещества и являются антагонистами других микроорганизмов;
• Быть устойчивыми к кислотам и желчным кислотам, а также к пищеварительным ферментам, чтобы они могли проходить через нужные участки пищеварительного тракта;
• Способны размножаться в организме и восстанавливать нормальную микробиоту;
• Уметь активировать иммунную систему организма;
• Устраните патогенные микроорганизмы или уменьшите вероятность их появления; 
• Способность сохранять жизнеспособность и стабильность в ходе технологических процессов при производстве конкретных рецептур и оставаться стабильными в течение определенного периода времени в производимых рецептурах;
• Отвечают необходимым требованиям для нормального производства продуктов питания, например, органолептическим свойствам, стабильности, жизнеспособности, и не обязательно участвуют в ферментации продукта (Toit и др.., 1998; Maragkoudakis и др.., 2006; Masteikienė, 2006);
• Продуцируют органические кислоты, перекись водорода и бактериоцины, которые противодействуют росту патогенов (Рид и др..,2003; Kaur и др., 2002; Ouwehand и др, 2004);
• Пробиотики также могут стимулировать и ускорять метаболические процессы в желудочно-кишечном тракте, что положительно сказывается на здоровье организма (Conway, 2001).

Больше всего исследований посвящено пользе пробиотиков при лечении кишечных инфекций. Было доказано, что пробиотики сокращают продолжительность диареи. Пробиотические бактерии также могут помочь защитить от диареи или других острых желудочно-кишечных расстройств (Sullivan, Nord, 2002). 

Существуют публикации о пользе пробиотиков Helicobacter polora для лечения и профилактики инфекций. H. pylori вызывает гастрит типа В и пептические язвы, а также является фактором риска развития рака желудка. Исследования показали, что лактобактерии подавляют H. pylori рост и уреазную активность, необходимую для выживания в кислой желудочной среде. Другие исследования показали, что пробиотики подавляют H. pylori инфекции и снижает риск рецидива. Эксперименты на мышах показали, что Lactobacillus salivarius защищает желудок от H. pylori инфекцию и подавляют ее. Исследования показали, что пробиотики высокоэффективны при непереносимости лактозы (Pavilionis et al., 2005).

1.4. Lactobacillus

Lactobacillus это грамположительные, палочковидные, неспорообразующие и каталазоотрицательные пробиотические бактерии. Они являются одними из наиболее важных молочнокислых бактерий, используемых в производстве продуктов питания и в качестве пробиотиков (Ortua и др. 2007).

Современная таксономия молочнокислых пробиотических бактерий включает лактобактерии, бифидобактерии и энтерококки. Пробиотические бактерии включают 176 штаммов. К ним предъявляются определенные требования: бактерии должны быть способны прикрепляться к стенке кишечника, быть генетически стабильными, устойчивыми к воздействию окружающей среды, хорошо размножаться in vitro и in vivo (Klein и др.., 1998).

В последнее десятилетие рынок функциональных продуктов, содержащих пробиотики, является самой быстрорастущей областью разработки новых пищевых продуктов. Функциональные продукты питания требуют новых пробиотических культур с полезными физиологическими свойствами (Sieladie и т.д.., 2011).

Молоко и продукты из него являются одной из сред для роста лактобактерий. Штамм молочнокислых бактерий определяется путем идентификации морфологических и биохимических показателей, таких как окрашивание по Граму и каталазный тест (Sujaya, 2008). Выживание при различных температурах, pH и соленой среде имеет важное значение для лактобактерий. 

Наиболее изученными микроорганизмами в настоящее время являются молочнокислые бактерии, особенно Lactobacillus виды и Bifidobacterium spp. (Rolfe, 2000). 

Лактобациллы - одни из самых крупных штаммов группы молочнокислых бактерий, названных так потому, что они превращают лактозу и другие сахара в молочную кислоту и очень устойчивы к желудочно-кишечной среде желудка и желчных кислот (Rayid и др.., 2007; Khali и т.д.., 2007; Abdelbasset и др.., 2008).

Lactobacillus Палочковидные бактерии размером от 1,0 до 10 x 0,5-1,2 мкм и формой от вытянутой палочки до коккобациллы. Эти бактерии образуют короткие цепочки, особенно в поздней логарифмической фазе роста. Большинство лактобацилл неподвижны, не образуют спор, имеют окраску Грам+, старые культуры при повышении рН среды становятся Грам-. Они являются факультативными анаэробами (некоторые микроаэрофилы), отрицательны по каталазе и цитохромоксидазе. Более быстрый рост лактобацилл наблюдается в среде с 5 -10% CO₂ концентрация. Он лучше растет в присутствии определенных веществ - аминокислот, пептидов, жирных кислот, витаминов, углеводов и нуклеиновых кислот. Оптимальная концентрация pH составляет 5,5 - 5,8, а температура роста - 30 - 40 ⁰C, но растет при температурах от +5 до +53 ⁰C (Axelsson, 1998). 

Пробиотические молочнокислые бактерии обитают в самых разных экологических нишах, таких как растения, пищеварительный тракт животных и человека, ротовая полость, влагалище и сырое молоко. Их также можно обнаружить в воде, сточных водах, почве, навозе и силосе (Hammes, Vogel, 1995). Наиболее распространенными продуктами питания являются молоко, зерновые и мясные продукты, овощи, фрукты, соки, вино, пиво (Jaymanne и др.., 2006).

Род Lactobacillus включает 133 вида и 18 подвидов (Liu, 2011). Лактобациллы делятся на строго гомоферментативные (L. planarum, L.

acidophilus, L. casei. L. salivarium), строгая гетероферментация и факультативная гетероферментация.

Гомоферментативные лактобактерии расщепляют глюкозу, фруктозу, галактозу, мальтозу, сорбит и производят около 85% молочной кислоты в процессе ферментации.

Гетерофертильные лактобактерии расщепляют глюкозу, ксилозу, арабинозу и рамнозу, в результате чего образуется меньшее количество молочной кислоты (50%).

Факультативные гетероферментативные лактобациллы занимают промежуточное положение. Они расщепляют пентозы (арабинозу, ксилозу и т. д.) и гексозы (глюкозу, фруктозу, мальтозу и т. д.) с образованием молочной кислоты, а при истощении запасов глюкозы расщепляют ее до уксусной кислоты и спирта (Wood and Holzapfel, 1998).

Лактобациллы используются в промышленных масштабах при производстве йогурта, вина, сидра, квашеной капусты, солений, сыра, шоколада и других ферментированных продуктов (Bixquert, 2009).

1.4.1. Lactobacillus acidophilus

Lactobacillus acidophilus это грамположительные, спорообразующие, гомоферментативные, каталазоотрицательные палочки. Они растут в среде с относительно низким pH (менее pH 5,0) и оптимальной температурой роста 37 ⁰C. (Bâati и др. 2000). Эти бактерии естественным образом живут в желудочно-кишечном тракте человека, во рту и влагалище, содержатся в некоторых ферментированных продуктах (например, кефире, йогурте и т. д.), а также используются при производстве пробиотических продуктов и пищевых добавок.

Как и большинство лактобацилл, L. acidophilus Ферментирует лактозу в молочную кислоту. L. acidophilus кишечник и влагалище создают неблагоприятные условия для роста патогенных и относительно патогенных бактерий. Эти пробиотические бактерии важны для пищеварения, они отделяют аминокислоты от желчи, тем самым способствуя повторному использованию аминокислот организмом. Научные исследования показали, что L. acidophilus снижает уровень холестерина в крови, повышает естественный иммунитет, облегчает диарею, повышает устойчивость к грибковым инфекциям. Содержащие пробиотики L. acidophilus Полезен для балансировки микрофлоры кишечника при ряде желудочно-кишечных расстройств, таких как диарея, запоры, ротавирусная инфекция, язва желудка или двенадцатиперстной кишки, язвенный колит, болезнь Крона, синдром раздраженного кишечника, кандидоз. 

Очень редко эти бактерии ассоциируются с инфекциями (Anderson, Gilliland 1999; Aguirre, Collins, 1993; Gasser, 1994; Salminen и др.. 1998; Borriello и др.. 2003).

Исследования in vitro показали, что L. acidophilus обладает высокой устойчивостью к низкому pH и может выживать в двенадцатиперстной кишке в присутствии желчных кислот. Взаимодействие со слизистой оболочкой кишечника очень важно, поскольку связывание со слизистой оболочкой позволяет пробиотикам дольше сохраняться в кишечнике. Это также может защитить от кишечных патогенов. Было показано, что L. acidophilus Очень хорошо прикрепляется к эпителию пищеварительного тракта человека.

Более 90 % всех предприятий ЕС L. acidophilus сохраняют жизнеспособность в течение 1 часа в растворе соляной кислоты и пепсина (1 %) при температуре 37 ⁰C и pH 3.

Более 90 % всех предприятий ЕС L. acidophilus Выживает в среде, содержащей 0,3% желчной кислоты.

В ЕС проживает более 60 % граждан. L. acidophilus Выживает в течение 1 часа в среде, содержащей 0,3 % пепсина при pH 2.

Daugiau nei 60 proc. laktobacilų išlieka gyvybingos, terpėje 2 val. esant 0,1 proc. pankreatino koncentracijai, kai pH 8. (http://ss1.spletnik.si/4_4/000/000/19f/152/La-14%20TM.pdf. Prieiga per internetą 2013 01 21 ).

1.4.2. Lactobacillus bulgaricus

Lactobacillus delbrueckii subsp. (подвид) bulgaricus (с 1984 года известна как Lactobacillus bulgaricus). Это одна из нескольких бактерий, используемых при производстве йогурта и других ферментированных продуктов.

Это длинная, нитевидная грамположительная палочка. Она неподвижна, не образует спор и растет при низком pH (около 5,4 - 4,6). L. delbrueckii spp. bulgaricus обычно используется при производстве йогурта в сочетании с Streptococcus thermophilus (Куртин и др.., 2003). Два Lactobaclillus виды действуют синергетически. Оба вида производят молочную кислоту, которая придает йогурту кислый вкус и действует как консервант (Zourari и др..,1992). L. bulgaricus это гомоферментативная молочнокислая бактерия, которая ферментирует глюкозу, лактозу, фруктозу, а иногда галактозу или маннозу. Температура роста до 48-50 ⁰C. (Kandler, Weiss, 1986). L. bulgaricus Пробиотическая активность связана с их способностью продуцировать антимикробные вещества, такие как бактериоцины, органические кислоты и перекись водорода (Стаматова, 2010).

1.4.3. Lactobacillus rhamnosus

Известная пробиотическая бактерия Lactobacillus GG защищает и восстанавливает пищевые антигены (Isolauri и др.. 1993; Малин и др. 1997) или наркотики (Готланд и др. 2001) повышает проницаемость слизистой оболочки. Эта бактерия стимулирует секрецию слизистой оболочки кишечника (Mack и др.. 2003) и защищает плотные соединения эпителиальных клеток от повреждения в присутствии кишечная палочка инфекция (Халед и др.. 2003).

Молочнокислая бактерия Lactobacillus GG (L. rhamnosus ATCC 53103) - самый известный и наиболее изученный пробиотик. Он сохраняет жизнеспособность в среде желудочно-кишечного тракта, колонизирует слизистую оболочку кишечника и эпителиальные клетки, укрепляет иммунную защиту от вредных бактерий и вирусов. При регулярном приеме Lactobacillus GG адаптируется к нормальной бактериальной флоре. Он увеличивает количество не только молочной кислоты, но и бифидобактерий. Lactobacillus GG положительно влияет на обменные процессы в желудочно-кишечном тракте, препятствуя образованию вредных веществ в толстом кишечнике и связывая токсины. Подавляет рост и адгезию потенциально опасных бактерий.

Lactobacillus rhamnosus  способность выживать в пищеварительном тракте человека (Doron  и др.., 2005).

1.4.4. Lactobacillus plantarum

Lactobacillus plantarum  - Непатогенные, 2-4 мкм длиной, грамположительные, аэробные палочки, которые естественным образом встречаются в желудочно-кишечном тракте человека. Мелкие, склонны к образованию цепочек, часто с квадратными концами, мезофилл. Оптимальная температура развития 30 ^oC - 35 ^oC, минимум - 10 ^oC - 15 ^oC, максимум - 45 ^oC - 50 ^oC. Термостойкость: 60 ^oC, убивает в течение 10 минут, но выдерживает кратковременное нагревание 72 ^oC. Он ферментирует сахарозу и мальтозу и производит молочную кислоту из лактозы. L. plantarum устойчив к действию желчи и NaCl, может развиться при 6 % от нормы. NaCl (Masteikienė, 2002; Bixquert 2009). Они содержатся в различных ферментированных продуктах, таких как молоко, мясо, рыба, растения; в ферментированных кормах; в пищеварительном тракте человека и животных.

 L. plantarum также содержится во многих видах сыра (Vanderhoof, 2001). Вандерхуф подчеркнул. L. plantarum способность создавать благоприятные условия для профилактики энтероколита у крыс и эффективно лечить детей с недостатком хороших бактерий в кишечнике. Было показано, что помимо улучшения пищеварения L. plantarum эффективен при лечении синдрома раздраженного кишечника, колита и болезни Крона (Vriesa и др.., 2006). Niedzielin и др. обнаружили, что люди с синдромом раздраженного кишечника, получающие лечение L. plantarum, значительное уменьшение боли в животе (Niedzelin и др.., 1998). L. plantarum обладает способностью уничтожать патогенные микроорганизмы и сохранять важные питательные вещества, витамины и антиоксиданты, а также способностью производить L-лизин, полезную аминокислоту. Последние поступления L. plantarum Исследования показали, что эти бактерии могут быть эффективны в профилактике аллергии на сою. Ученые из Университета Иллинойса провели два исследования в 2008 году. Они ферментировали семена сои, муку и продукты питания с помощью микроорганизмов. Ферментированные и неферментированные соевые продукты вводились в плазму крови людей, страдающих аллергией на сою. L. plantarum вызывал наибольшее снижение иммунного ответа на соевые продукты. Э. Хаушильдт в исследованиях на лабораторных животных обнаружил, что этот пробиотик улучшает функцию печени, снижает риск воспаления и вздутия живота у пациентов с синдромом раздраженного кишечника, повышает уровень фекальных карбоновых кислот и снижает уровень фибриногена в крови (Hauschildt, 2001). L. plantarum Колония живет в кишечнике, не дает патогенам прикрепиться к слизистой оболочке, конкурирует за пищу и выводит вредные бактерии из организма, не причиняя вреда. Эти бактерии также устойчивы ко многим антибиотикам (Vriesa и др.., 2006).

Lactobacillus plantarum производит следующие бактериоцины: плантарицин А (PlnA), PlnE, PlnF, PlnJ, PlnKit PlnN (Anderssen и т.д.., 1998).  L. plantarum продуцирует плантарицин С, который убивает тучные клетки, действуя через цитоплазматическую мембрану, является бактерицидным в чувствительных культурах и в некоторых случаях вызывает лизис клеток. Бактериоцины часто имеют узкий ингибирующий спектр, но лактобациллы компенсируют это, вырабатывая несколько бактериоцинов, которые принадлежат к разным классам и имеют разные ингибирующие спектры (Klaenhammer, 1988; Eijsink и др.., 2002).

Некоторые LactobacillusШтаммы вырабатывают антибактериальные вещества - бактериоцины, обладающие различной активностью в отношении разных Yersinia enterocolitica, Salmonella, E. coli O157:H7 и кишечная палочка Штаммы K88. Эти штаммы были значительно более восприимчивы L. plantarum синтезированных бактериоцинов. L. plantarum также вырабатывают противогрибковые вещества (Laniewska - Moroz и т.д.., 2001).

Он также обладает уникальным свойством прикрепляться к слизистой оболочке кишечника через маннозные рецепторы, что не характерно для батарей Грам+, но характерно для Грам-. Это свойство позволяет L. plantarum конкурируют с патогенными бактериями (например, Salmonella) (Adlerberth и др.., 1996). Адгезия патогенных бактерий является наиболее важным механизмом, с помощью которого они закрепляются в кишечнике (Patti, Höök, 1994).

Ниссен и др. in vitro обнаружили, что L. plantarum может улучшить целостность кишечника, метаболическую активность клеток кишечника и стимулировать иммунный ответ (Nissen и др. 2009).

Есть данные, что влияние антибиотиков на пищеварительный тракт снижается за счет L. plantarum потребление (Лоннермарк и др. 2009). Также было установлено, что L. plantarum может защищать эпителиальные клетки кишечника, поврежденные кишечная палочка (Цинь и др. 2009).

L. plantarum Широко используется в пищевой промышленности и в качестве пробиотика в медицине (http://www.ipm-

int.org/boxmode/pdf/lactobacillus_plantarum.pdf. Accessed on 02.10.2012).

1.4.5. Lactobacillus fermentum

Lactobacillus fermentum это мезофильные палочковидные бактерии среднего размера толщиной 0,5-0,7 мкм и длиной до 5 мкм, живущие поодиночке или цепочками. Оптимальная температура их развития составляет 18-30 ^oC, минимум - 10 ⁰C, максимум - 45 ⁰C. Они ферментируют различные сахара, такие как глюкоза, лактоза, раффиноза, мальтоза, и выделяют до 1,2 % молочной кислоты, уксусную кислоту, этиловый спирт и углекислый газ. Широко распространены на растениях, используются для ферментации фруктов, овощей, силосования кормов (Masteikienė, 2002; Songisepp  и др.., 2005 ).  

L. fermentum является облигатной гетероферментативной молочнокислой бактерией (Canchaya и др.., 2003) Большинство штаммов продуцируют бактериоцины и расщепляют трудноперевариваемые сахара - раффинозу и стахиозу (Songisepp и др.., 2005).

Хорошо выживает в пищеварительном и кишечном трактах животных и человека. Вырабатывает лизоцим, газ из глюкозы и NH₃ из аргинина. Каталазоотрицательная, не образующая спор, неподвижная, ферментирующая рибозу, галактозу, D-глюкозу, D-тагатозу и глюконат (http://enologyaccess.org. Accessed 19.12.2013).

Lactobacillus fermentum Увеличивает выработку секреторного антисальмонеллезного IgA, активирует фагоциты и уменьшает колонизацию печени и других органов сальмонеллами (Reid и др.., 2002). 

Эксперименты in vitro показали, что L. fermentum Инактивирует до 10¹⁰ аденовирусы и вирионы везикулярного стоматита в течение 10 минут, с эффектом, аналогичным эффекту обработки кислотой (Candieux и др.., 2002).

Из микрофлоры человека только лактобактерии L. fermentum могут вырабатывать лизоцим, входящий в семейство факторов, играющих важную роль в защите механизмов человека от инфекционных агентов. Ведь секреторные антитела связывают комплемент и становятся бактериоцидными только в присутствии лизоцима, а лизоцим участвует в регуляции микрофлоры (Jankauskiene 1996). L. fermentum Производство лизоцима улучшает адгезивные свойства лактобацилл, усиливает иммуномодулирующие, антианемические, регенеративно-стимулирующие и другие биологические свойства (Шендеров, 1996)

Он обнаружил, что один L. fermentum Штаммы способны прикрепляться к эпителию слизистой желудка in vitro, но не к эпителию тонкого и толстого кишечника, в то время как другие штаммы способны прикрепляться к эпителию тонкого и толстого кишечника. Таким образом, адгезивные свойства лактобацилл зависят от штамма и тканевой специфичности микроорганизма (Day and Lisanski, 1990).